マウス胎仔肝前駆細胞の分離

マウス胎仔からの肝前駆細胞分離・培養系

マウス肝臓からの細胞回収法

準備

37℃ウォーターバスの準備

EGTAバッファー

コラゲナーゼバッファーの確認・37℃でインキュベート

１．マウス胎児をPBSで洗って、手術的に肝臓を摘出（クリーンベンチ内で作業を行う）

妊娠マウス（胎生13日前後のもの）を頸椎脱臼させた後に、開腹し子宮を取り出す。マウスの子宮はYの形になっているので、両方を取り出してPBSで洗う。子宮からマウス胎児を取り出しPBSで洗ったのちに胎盤を切り離す（図１-２）。

実体顕微鏡下で、胎児から肝臓（赤い臓器として確認できる）をピンセットで取り出し、付着している腸管等を丁寧に外す。

取り出した胎児肝臓を10cmDish（非接着性のPetri dishなど）に入れ、EGTAバッファーを入れる（図３）。

２．摘出した肝臓をEGTA バッファー10ml/8-10胎児に移して、はさみで1mm角以下ぐらいに肝臓をばらばらにする（図４-5）

（低吸着DishにPerfusion Bufferを10ml無菌的に取り、摘出した肝臓をはさみでばらばらにする）

３．10mlのピペットで15ml遠心チューブに肝臓とバッファーを移したのちに、37℃のウォーターバスでインキュベートする（5分）

（図６、肝臓がピペットにくっつきやすいので、少しずつチューブに移す）

４．1000rpm、4分で遠心（室温）、上清をアスピレートする

５．コラゲナーゼ溶液（あらかじめ37℃にインキュベートしておく）を10ml加えて、37℃で15分、ピペッティングをはさんで+5min　ぐらい溶けるまでインキュベートする。

６．ピペッティングで細胞をばらばらにする。＋5ml DMEM10%FCS培地で酵素反応をストップする。

必要な試薬類

１

４

２

３

５

６

７．1000rpm、4分で遠心（室温）、上清をアスピレートする

８．＋10ml PBS+3%FCSで細胞をWashする。遠心前に滅菌したフィルターでフィルトレーションを行う（図７）

９．1000rpm、4分で遠心（４℃）、上清をアスピレートする。沈殿した細胞を回収し、PBSで２回Washする。

１０．細胞の沈殿物に、50ulのPBS+3%FCSおよび+0.5ulのBiotin-anti CD45およびBiotin-anti Ter119を加える。

（胎仔１０匹あたり１チューブ用の量、胎仔数に合わせてBuffer/抗体量を増やす）

１１．氷上：振とう機で20-30分インキュベートする。

１２．+50ulのDynabeads MyOne Streptavidin C1を5ml PBS+3%FCSでWashする（胎仔１０匹あたり、胎仔数に合わせてBuffer/抗体量を増やす）。DynalBeadsセパレーターに15mlチューブを入れて5分ほど待つ。そのまま上清をアスピレートする。両側の磁石にビーズが結合しているので、チューブの真ん中を吸い上げること。

１３．１１のサンプルに+10mlのPBS+3%FCSを加えてWashする。1000rpm、4分で遠心（４℃）、上清をアスピレートする

１４．残ったビーズに50ulのPBS+3%FCSを加えてビーズを回収し、サンプル（１３で遠心したもの）に加える。

１５．氷上：振とう機で20-30分インキュベートする。

１６．5mlのPBS+3%FCSを加えて、Dynal用磁石にチューブを入れて5分ほど待つ。そのまま上清をピペットで回収し、別のチューブに移す（図８）。（この時両側にビーズが結合しているので、チューブの真ん中を吸い上げること）

１７．1000rpm、4分で遠心（４℃）、上清をアスピレートする

１８．＋75ulのPBS+3%FCSおよび1.5ulのanti-Dlk antibody　(-20℃抗体BOX）を加える。（胎仔１０匹あたり、胎仔数に合わせてBuffer/抗体量を増やす）。

１９．氷上：振とう機で20-30分インキュベートする

２０．5mlのPBS+3%FCSで細胞をWashする。1000rpm、4分で遠心（４℃）、上清をアスピレートする

２１．＋70ulのPBS+3%FCSおよび30ulのMACSビーズ（anti-Rat）(-4℃抗体BOX）を加える。（胎仔１０匹あたり、胎仔数に合わせてBuffer/ビーズ量を増やす）

２２．氷上：振とう機で20-30分インキュベートする。

２３． MACSカラム（LSカラム）とMACSセパレーターを準備。LSカラムに3mlのPBS+3%FCSを入れて自然落下でWashする（図９）。

２４．２２のサンプルを5mlのPBS+3%FCSでWash. 1000rpm、4分で遠心（室温）、上清をアスピレートする。+500ulのPBS+3%FCSを加えて沈殿した細胞を拡販する。（胎仔１０匹あたり、胎仔数に合わせてBufferやカラム数を増やす）。

２５．カラムの黒い部分に細胞をのせる。自然落下で溶液が全部でたら、3mlのPBS+3%FCSを加えてWashを3回行う。

２６．カラムを磁石から外して、15mlの遠心チューブに移す。5mlのPBS+3%FCSで細胞を溶出する。（自然落下で行い、最後にピストンで全量を押し出す）

２７．細胞をピペットでMixし、10ul＋染色液10ulをよく混ぜて、血球計算板に10ulを載せて細胞をカウントする。

７

８

９